Рибонуклеаза

В вирусах

Кристаллическая структура гетеродимера обратной транскриптазы ВИЧ (желтый и зеленый) с доменом РНКазы H, показанным синим цветом (активный центр в пурпурных сферах). Оранжевая цепь нуклеиновой кислоты — это РНК, красная цепь — это ДНК.

Две группы вирусов используют обратную транскрипцию как часть своего жизненного цикла: ретровирусы , которые кодируют свои геномы в одноцепочечной РНК и реплицируются через промежуточную двухцепочечную ДНК; и вирусы дцДНК-ОТ , которые реплицируют свои геномы двухцепочечной ДНК через промежуточный «прегеном» РНК. Патогенные примеры включают вирус иммунодефицита человека и вирус гепатита B соответственно. Оба кодируют большие многофункциональные белки обратной транскриптазы (RT), содержащие домены РНКазы Н.

Ретровирусные белки RT из вируса ВИЧ-1 и мышиного лейкоза являются наиболее изученными членами этого семейства. Ретровирусная ОТ отвечает за преобразование генома одноцепочечной РНК вируса в двухцепочечную ДНК. Этот процесс требует трех этапов: во-первых, РНК-зависимая активность ДНК-полимеразы производит ДНК из матрицы плюс-цепи РНК, генерируя промежуточный гибрид РНК: ДНК; во-вторых, цепь РНК разрушается; и в-третьих, ДНК-зависимая активность ДНК-полимеразы синтезирует ДНК с положительной цепью, образуя двухцепочечную ДНК в качестве конечного продукта. Второй этап этого процесса осуществляется доменом РНКазы H, расположенным на С-конце белка RT.

РНКаза H выполняет три типа расщепляющих действий: неспецифическая деградация генома плюс-цепи РНК, специфическое удаление праймера тРНК минус-цепи и удаление праймера богатого пуринами полипуринового тракта (PPT) плюсовой цепи. РНКаза H играет роль в праймировании плюс-цепи, но не в обычном способе синтеза новой последовательности праймера. Скорее, РНКаза H создает «праймер» из PPT, который устойчив к расщеплению РНКазой H. Удалив все основания, кроме PPT, PPT используется в качестве маркера для конца области U3 его длинного концевого повтора .

Поскольку активность РНКазы H необходима для вирусной пролиферации, этот домен считается лекарственной мишенью для разработки антиретровирусных препаратов, используемых для лечения ВИЧ / СПИДа и других состояний, вызванных ретровирусами. Идентифицированы ингибиторы ретровирусной РНКазы H нескольких различных хемотипов , многие из которых имеют механизм действия, основанный на хелатировании катионов активного центра. Ингибиторы обратной транскриптазы, которые специфически ингибируют функцию полимеразы RT, широко используются в клинической практике, но не ингибиторы функции РНКазы H; это единственная ферментативная функция, кодируемая ВИЧ, на которую еще не нацелены лекарства, применяемые в клинической практике.

Состав

Сравнение структур репрезентативных белков рибонуклеазы H каждого подтипа. В белке E. coli (бежевый, вверху слева) четыре консервативных остатка активного сайта показаны сферами. В белках H. sapiens структурное ядро, общее между подтипами H1 и H2, показано красным. Структуры визуализируются из: E. coli , ; T. maritima , ; B. stearothermophilus , ; H. sapiens H1, ; H. sapiens , .

Структура РНКазы Н , обычно состоит из 5- ти многожильных бета-листа , окруженного распределением альфа-спирали . Все РНКазы H имеют активный сайт, сосредоточенный на консервативном мотиве последовательности, состоящем из остатков аспартата и глутамата , часто называемом мотивом DEDD. Эти остатки взаимодействуют с каталитически необходимыми ионами магния .

РНКазы H2 больше, чем H1, и обычно имеют дополнительные спирали. Домена организация ферментов изменяется; некоторые прокариотические и большинство эукариотических членов группы H1 имеют дополнительный небольшой домен на N-конце, известный как «гибридный связывающий домен», который облегчает связывание с гибридными дуплексами РНК: ДНК и иногда обеспечивает повышенную процессивность . В то время как все члены группы H1 и прокариотические члены группы H2 действуют как мономеры, ферменты H2 эукариот являются облигатными гетеротримерами . Прокариотические ферменты HIII являются членами более широкой группы H2 и имеют общие структурные особенности с H2 с добавлением N-концевого связывающего домена TATA-бокса . Домены ретровирусной РНКазы H, встречающиеся в мультидоменных белках обратной транскриптазы, имеют структуру, очень напоминающую группу H1.

РНКазы H1 были тщательно изучены для изучения взаимосвязи между структурой и ферментативной активностью. Они также используются, особенно гомолог E. coli , в качестве модельных систем для изучения сворачивания белков . Внутри группы H1 была выявлена ​​взаимосвязь между более высокой аффинностью связывания субстрата и наличием структурных элементов, состоящих из спирали и гибкой петли, обеспечивающих большую и более основную поверхность связывания субстрата. C-спираль имеет разбросанное таксономическое распределение; он присутствует в гомологах E. coli и человеческой РНКазы H1 и отсутствует в домене РНКазы H ВИЧ, но примеры ретровирусных доменов с С-спиралями действительно существуют.

Функция

Ферменты рибонуклеазы Н расщепляют фосфодиэфирные связи РНК в двухцепочечном гибриде РНК: ДНК, оставляя 3′- гидроксильную и 5′- фосфатную группы на обоих концах участка разреза с механизмом катализа с двумя ионами металлов, в котором две двухвалентные катионы, такие как Mg2 + и Mn2 +, непосредственно участвуют в каталитической функции. В зависимости от различий в их аминокислотных последовательностях эти РНКазы H классифицируются на РНКазы 1 и 2 типа H. РНКазы H типа 1 содержат прокариотические и эукариотические РНКазы H1 и ретровирусные РНКазы H. РНКазы H типа 2 содержат прокариотические и эукариотические РНКазы H2 и бактериальная РНКаза H3. Эти РНКазы H существуют в мономерной форме, за исключением эукариотических РНКаз H2, которые существуют в гетеротримерной форме. РНКазы H1 и H2 имеют разные предпочтения в отношении субстратов и разные, но частично совпадающие функции в клетке. У прокариот и низших эукариот ни один из ферментов не важен , тогда как оба считаются важными для высших эукариот. Комбинированная активность ферментов H1 и H2 связана с поддержанием стабильности генома из-за деградации ферментами РНК-компонента R-петель .

Рибонуклеаза H1

Идентификаторы
Условное обозначение РНКаза H
Pfam
Клан пфам
ИнтерПро
ПРОФИЛЬ
Доступные белковые структуры:
Pfam
 
PDB
PDBsum

Ферменты рибонуклеазы H1 требуют по меньшей мере четырех пар оснований, содержащих рибонуклеотиды, в субстрате и не могут удалить один рибонуклеотид из цепи, которая в противном случае состоит из дезоксирибонуклеотидов. По этой причине маловероятно, что ферменты РНКазы H1 участвуют в процессинге праймеров РНК из фрагментов Окадзаки во время репликации ДНК . РНКаза H1 не важна для одноклеточных организмов, где она была исследована; в E. coli нокауты РНКазы H1 придают чувствительный к температуре фенотип, а у S. cerevisiae они вызывают дефекты стрессовой реакции.

У многих эукариот, включая млекопитающих , гены РНКазы H1 включают митохондриальную нацеливающую последовательность , приводящую к экспрессии изоформ с присутствием MTS и без нее. В результате РНКаза H1 локализуется как в митохондриях, так и в ядре . В моделях мышей с нокаутом нокаутные мутанты по РНКазе H1 являются летальными во время эмбриогенеза из-за дефектов репликации митохондриальной ДНК . Дефекты репликации митохондриальной ДНК, вызванные потерей РНКазы H1, вероятно, связаны с дефектами процессинга R-петли .

Рибонуклеаза H2

Идентификаторы
Условное обозначение РНКаза HII
Pfam
Клан пфам
ИнтерПро
Доступные белковые структуры:
Pfam
 
PDB
PDBsum

У прокариот РНКаза Н2 ферментативно активна как мономерный белок. У эукариот это облигатный гетеротример, состоящий из каталитической субъединицы A и структурных субъединиц B и C. В то время как субъединица A близко гомологична прокариотической РНКазе H2, субъединицы B и C не имеют явных гомологов у прокариот и плохо сохраняются в последовательность уровня даже среди эукариот. Субъединица B опосредует белок-белковые взаимодействия между комплексом H2 и PCNA , который локализует H2 в фокусах репликации .

Как прокариотические, так и эукариотические ферменты H2 могут расщеплять отдельные рибонуклеотиды в цепи. однако у них несколько разные модели расщепления и предпочтения субстратов: прокариотические ферменты имеют более низкую процессивность и гидролизуют последовательные рибонуклеотиды более эффективно, чем рибонуклеотиды с 5′- дезоксирибонуклеотидом, в то время как эукариотические ферменты более процессивны и гидролизуют оба типа субстрата с одинаковой эффективностью. Субстратная специфичность РНКазы H2 придает ей роль в эксцизионной репарации рибонуклеотидов , удаляя неправильно инкорпорированные рибонуклеотиды из ДНК, в дополнение к процессингу R-петли . Хотя и H1, и H2 присутствуют в ядре клетки млекопитающих , H2 является доминирующим источником активности РНКазы H и важен для поддержания стабильности генома.

Некоторые прокариоты обладают дополнительным геном Н2-типа, обозначенным РНКазой HIII в римско-цифровой номенклатуре, используемой для генов прокариот. Белки HIII более близки к группе H2 по идентичности последовательностей и структурному сходству, но имеют предпочтения в отношении субстратов, которые больше напоминают H1. В отличие от HI и HII, которые широко распространены среди прокариот, HIII обнаруживается только у нескольких организмов с разбросанным таксономическим распределением; он несколько чаще встречается у архей и редко или никогда не встречается в том же прокариотическом геноме, что и HI.

Механизм

Механизм реакции для катализа РНКазы H с использованием двух ионов металлов в домене РНКазы H ВИЧ-1

Активный сайт почти всех РНКазы Н содержит четыре отрицательно заряженных аминокислотных остатков, известных как DEDD мотив; часто также присутствует гистидин, например, в ВИЧ-1, человеке или E. coli.

Заряженные остатки связывают два иона металла, необходимые для катализа; в физиологических условиях это ионы магния , но марганец также обычно поддерживает ферментативную активность, тогда как кальций или высокая концентрация Mg2 + подавляет активность.

Основываясь на экспериментальных данных и компьютерном моделировании, фермент активирует молекулу воды, связанную с одним из ионов металла, с помощью консервативного гистидина. Переходное состояние является ассоциативным по природе и образует промежуточное соединение с уходящей группой протонированного фосфата и депротонированного алкоксида. Уходящая группа протонируется через глутамат, который имеет повышенное значение pKa и, вероятно, протонируется. Механизм подобен РНКазе Т и субъединице RuvC в ферменте Cas9, которые также используют гистидиновый и двухметаллический ионы.

Механизм высвобождения расщепленного продукта до сих пор не выяснен. Экспериментальные данные кристаллографии с временным разрешением и аналогичных нуклеаз указывают на роль третьего иона в реакции, задействованной в активном центре.

В биологии человека

Геном человека содержит четыре генов , кодирующих РНКазы H:

  • RNASEH1 , пример подтипа H1 (мономерный)
  • RNASEH2A , каталитическая субъединица тримерного H2 комплекса
  • RNASEH2B , структурная субъединица тримерного H2 комплекса
  • RNASEH2C , структурная субъединица тримерного H2 комплекса

Кроме того, генетический материал ретровирусного происхождения часто появляется в геноме, что отражает интеграцию геномов эндогенных ретровирусов человека . Такие события интеграции приводят к присутствию генов, кодирующих обратную транскриптазу ретровируса , которая включает домен РНКазы Н. Пример — ERVK6 . Длинный концевой повтор (LTR) и не длинный концевой повтор (без LTR) ретротранспозоны также распространены в геноме и часто включают в свои собственные домены РНКазы H, со сложной эволюционной истории.

Роль в болезни

Структура тримерного комплекса H2 человека: каталитическая субъединица A выделена синим, структурная субъединица B — коричневым, а структурная субъединица C — розовым. Хотя субъединицы B и C не взаимодействуют с активным сайтом, они необходимы для активности. Каталитические остатки в активном центре показаны пурпурным цветом. Позиции, показанные желтым, соответствуют известным мутациям AGS. Наиболее распространенная мутация AGS — аланин на треонин в положении 177 субъединицы B — показана зеленой сферой. Многие из этих мутаций не нарушают каталитическую активность in vitro , но дестабилизируют комплекс или препятствуют белок-белковым взаимодействиям с другими белками в клетке.

В небольших исследованиях мутации в человеческой РНКазе H1 были связаны с хронической прогрессирующей внешней офтальмоплегией , общим признаком митохондриальных заболеваний .

Мутации в любой из трех субъединиц РНКазы Н2 хорошо известны как причины редкого генетического заболевания, известного как синдром Айкарди – Гутьера (AGS), которое проявляется в виде неврологических и дерматологических симптомов в раннем возрасте. Симптомы AGS очень напоминают симптомы врожденной вирусной инфекции и связаны с несоответствующей активацией интерферона I типа . AGS также может быть вызван мутациями в других генах: TREX1 , SAMHD1 , ADAR и MDA5 / IFIH1, каждый из которых участвует в процессинге нуклеиновой кислоты. При характеристике распределения мутаций в популяции пациентов с AGS было обнаружено 5% всех мутаций AGS в RNASEH2A, 36% в 2B и 12% в 2C. Мутации в 2B были связаны с несколько более легкими неврологическими нарушениями и с отсутствием индуцированной интерфероном активации генов, которая может быть обнаружена у пациентов с другими генотипами, связанными с AGS.

Классификация и номенклатура

Рибонуклеазы Н представляет собой семейство эндонуклеаз ферментов с общей подложки специфичности для РНК — нити РНК — ДНК — дуплексов . По определению, РНКазы H расщепляют фосфодиэфирные связи основной цепи РНК, оставляя 3′- гидроксильную и 5′- фосфатную группы. РНКазы H были предложены как члены эволюционно родственного суперсемейства, включающего другие нуклеазы и ферменты, обрабатывающие нуклеиновые кислоты, такие как ретровирусные интегразы , ДНК- транспозазы , резольвазы соединений Холлидея , белки Piwi и Argonaute , различные экзонуклеазы и сплайсосомный белок Prp8 .

РНКазы H можно в общих чертах разделить на два подтипа, H1 и H2, которым по историческим причинам даны арабские цифровые обозначения у эукариот и римские цифровые обозначения у прокариот . Таким образом, кишечная палочка РНКазы HI является гомологом человека разумного РНКазы H1. У E. coli и многих других прокариот ген rnhA кодирует HI, а ген rnhB кодирует HII. Третий родственный класс, называемый HIII, встречается у некоторых бактерий и архей ; он тесно связан с прокариотическими ферментами HII.

История

Рибонуклеазы H были впервые обнаружены в лаборатории Питера Хаузена, когда исследователи обнаружили активность эндонуклеаз гибридной РНК: ДНК в тимусе теленка в 1969 году и дали ей название «рибонуклеаза H », чтобы обозначить ее гибридную специфичность. Активность РНКазы H была впоследствии обнаружена в E. coli и в образце онковирусов с геномами РНК во время ранних исследований обратной транскрипции вирусов . Позже выяснилось, что экстракт тимуса теленка содержал более одного белка с активностью РНКазы Н и что E. coli содержала два гена РНКазы Н. Первоначально фермент, теперь известный как РНКаза Н2 у эукариот, был обозначен как H1 и наоборот, но названия эукариотических ферментов были изменены, чтобы соответствовать названиям в E. coli, чтобы облегчить сравнительный анализ, в результате чего получена современная номенклатура, в которой обозначены прокариотические ферменты. римскими цифрами и эукариотическими ферментами арабскими цифрами. Прокариотическая РНКаза HIII, о которой сообщалось в 1999 году, была последним идентифицированным подтипом РНКазы H.

Характеристика эукариотической РНКазы Н2 исторически была сложной задачей, отчасти из-за ее низкого содержания. Тщательные усилия по очистке фермента показали, что, в отличие от РНКазы H2 E. coli , эукариотический фермент имеет несколько субъединиц. S.cerevisiae , гомолог E.coli , белка (то есть, Н2А субъединица) было легко идентифицировать с помощью биоинформатики , когда дрожжи геном был секвенирован, но был найден соответствующий белок не иметь ферментативную активность в изоляции. В конце концов, дрожжевые субъединицы B и C были выделены совместной очисткой, и было обнаружено, что они необходимы для ферментативной активности. Однако субъединицы B и C дрожжей имеют очень низкую идентичность последовательностей со своими гомологами в других организмах, и соответствующие человеческие белки были окончательно идентифицированы только после того, как мутации во всех трех оказались причиной синдрома Айкарди-Гутьера .